紫外可见分光光度计的应用研究

qianshi2017

紫外可见分光光度计的应用研究 [复制链接]

紫外 / 可见分光光度计作为一种分子吸收光谱仪 , 广泛应用于化学研究、生物医药、环境科学和食品分析等研究领域。它具有分析精度高、应用范围广、分析简便快速和仪器灵敏度较高的优点 [1], 是目前大多数实验室常用的定量分析仪器。分光光度计所采用的分光光度法在定量分析领域中的应用已有数十年的历史 , 至今仍是实验室中最常用的分析方法之一。随着现代科学仪器的不断发展 , 在传统的追求准确、快速、可靠的同时 , 小型化、智能化、在线化、网络化成为了现代紫外 / 可见分光光度计新的增长点 [2]。
本文重点介绍的美国 BECKMAN 公司的 DU-730 紫外 / 可见分光光度计 , 是目前最具先进性的全波长分光光度计。BECKMAN 公司研发紫外 /可见分光光度计历史悠久 , 产品的性能优良 , 长期以来一直受到用户的好评。近年推出的 DU-730 型分光光度计又以崭新的面貌吸引着广大用户 , 以它先进的“微聚焦光束技术”(micro-focused beam)适应当今飞速发展的生物医学研究的需要 , 向更微量、更灵敏的分析技术尖端迈进。

1　 DU-730 紫外 / 可见分光光度计的结构和原理
1.1　结构组成
DU-730 分光光度计的基本组成和大多数分光光度计一样 , 都是由光源、单色器、比色池、光电检测器和放大器几部分组成。
1.1.1　光源
DU-730 分光光度计的紫外 / 可见区的光源仍是采用卤素钨灯和氘灯。卤素钨灯的工作波长范围为 :320 ～ 2500nm, 氘灯的工作波长范围为180 ～ 375nm。两光源有仪器上的一个灯选择反射镜自动进行选择和光源切换。
1.1.2　单色器 ( 分光系统 )
单色器是分光光度计的重要部分 , 比滤光片选择波长能更有效地提供带宽窄的单色光。DU-730是采用先进的光栅单色器 , 由入射狭缝、出口狭缝、色散元件、准直镜等光学元件组成。入射狭缝是用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辨率。而准直镜 ( 反射凹面镜 ) 的作用一是将入射光束变为平行光束后再进入色散元件，二是把来自色散元件的平行光束聚焦于出口狭缝上 , 形成光谱像。出口狭缝是单色光的出口，它只让光谱带中所需要波长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住 ,不让其通过 [3]。
色散元件是单色器中的核心元件，起着将复合光分解为单色光的作用。DU-730 分光光度计的色散元件是凹面反射式全息光栅 , 它本身就起着分解复合光和准直镜 ( 聚焦 ) 的作用 , 而且全息光栅具有杂散光小、不产生伪线和分辨率高的优点。
1.1.3　比色池
DU-730 分光光度计配有多种规格样品池架和比色杯。池架有标准池架、七位池架、50霯 微量池架和多形态样品池架。比色杯有常量 (2 ～ 4mL)、半微量 (0.5 ～ 1mL) 和微量 (50 ～ 100霯), 使用方便。另外还配有样品架卡套 , 分为特为酶动力学设计的半导体温控池 : 温度范围 15 ～ 50℃ , 和流动池。
1.2　工作原理
分光光度计的工作原理与其他分光光度计基本相同。由光源发出的复合光经反射镜进入单色器的入射狭缝，经准直镜变为平行光束投射到色散元件 - 光栅上，分解为单色光。测定所需要的波长的光经滤光片轮的选择后，从出口狭缝中穿出，经反射镜反射聚焦，透射入比色杯中。此时，特征波长的光被样品溶液吸收掉，与其互补色的光透过比色杯照射在光电检测器上，光信号被转变为电信号，经放大、数据传输、保存，到测量结果的显示。
BECKMAN 公司的 DU-730 分光光度仪的先进之处在于 : 在做微量分析时，当光束进入比色杯池前采用了该公司的专利技术—“微聚焦光束技术”,可以集中光源于样品上，避免光量的流失，因此 , 不论是使用标准池，还是 50霯 的微量池，仪器都能准确的进行测定，大大提高了仪器检测的灵敏度和结果的精密度。
从上图可以看出 ,“微聚焦光束技术”不同于普通的微量分析。聚焦的光源能量全部穿过样品中 ,没有损失。而普通的微量分析存在光能量的损失 ( 高达 80%), 降低了仪器检测的灵敏度和重现性。UD-730 分光光度计就是通过采用国际先进的“微聚焦光束技术”, 克服了在微量分析时存在的光能量损失的技术问题 , 大大提高了做微量分析时仪器的检测灵敏度 , 跃居光谱分析仪的国际领先地位。

2　DU-730 分光光度计的主要技术参数
2.1　光学设计
a) 光源 : 钨灯和氘灯；b) 微聚焦光束技术；c)光束的大小 :0.5×2.2mm。
2.2　检测参数
a) 波 长 范 围 :190 ～ 1100nm；b) 波 长 精度 :±1nm；c) 波 长 重 现 性 : ±0.1nm；d) 光 学 读数 : - 0.300 ～ 3.000；d) 光 学 精 度 : ±0.005A( 于0.0 ～ 0.5A)。

3　DU-730 分光光度计的应用领域
DU-730 分光光度计不仅包括了普通分光光度计的单一波长测定 , 还引进了先进的计算机技术 ,将单一组分的定量分析和蛋白质 / 核酸的生物学分析程序化 , 并具有数据传输、保存等软件功能。
3.1　单一波长测定 (Fixed Wavelength)
在这一分析模式里 , 我们可以选择不同波长 ,对样品的吸光值 (A) 进行测定 , 然后 , 将 A 值代入公式 , 直接计算出样品中某种组分的含量。这个功能是分光光度计应用最多 , 很多生物活性物质的含量分析 ( 试剂盒法 ) 大多采用单一波长测定来计算组分的浓度。这种测定方法简便、快速、实用 , 只测定吸光值 , 不用做标曲 , 深受实验室中广大研究者和技术人员的欢迎 , 只要方法灵敏度足够、发色基团稳定、仪器的精密度高 , 单一波长测定法还是较理想的一种定量分析方法。下表列出了目前我室利用 DU-730 分光光度计开展的检测项目。
3.2　全波长扫描 (Wavelength Scan)
DU-730 分光光度计具有扫描功能。当我们要建立方法或了解样品的特征吸收峰在的确切波长时，需要对样品进行一定范围的波长扫描 , 利用这一功能来优化仪器的灵敏度。仪器可以同时记录扫描图形和扫描数据，并保存图形和数据，扫描结束后可以方便的对样品的扫描图形进行分析，找出最大吸收波长，既可以对已知方法进行验证，又能对方法进行优化，常在建立检测方法时应用。
3.3　单一组分分析 (Single Componet Analysis)
单一组分分析也是分光光度计很有用的一个功能 , 它能准确定量出样品中某种组分的含量 , 但需要有标准溶液。用这一分析模式进行测定时，先要通过对一系列已知浓度的标准溶液 X 值进行测定，读出一系列响应值 Y 吸光值 ，由已知浓度 X 值和响应值 Y 计算出线性方程 Y=bX+a，仪器自动计算出给出线性方程的斜率（b）、截距 (a)、CV(%) 值等参数 , 然后利用该回归方程求出未知样品的浓度值 [4]。当测定未知样品时 , 仪器能自动给出浓度值 , 非常快速准确。此模式多用于组织或细胞的生化物质 ( 蛋白、维生素、盐离子等 ) 浓度测定等。
3.4　动力学 / 时间分析 (Kinetic/Time Mode)
这一新增的分析模式扩大了分光光度计的应用范围。借助于分光光度计法可以得出一些化学反应速度常数 [5]，过去是手工一个点一个点的测定的酶促动力学读数，而今天已经是全程自动化分析，大大解放了劳动力，更适应当今科学发展的需要。目前，我室已经开展线粒体密度的实时测定技术，例如 : 当我们在研究细胞损伤时，可以通过对细胞内的线粒体通透性转换孔 (mTPT) 的测定来判断线粒体受损后的肿胀程度进而推测细胞的损伤程度。实际操作就是 : 通过测定线粒体在高糖溶液中的透光率 (%T)的改变，即当心肌细胞发生病理改变时回开放 mPTP使线粒体发生肿胀，样品的透光率就会下降，监测线粒体溶液的透光率动态曲线下降的情况，就直接反映出线粒体的水肿情况，间接地反映了细胞的损伤和凋亡，这对研究细胞的损伤和保护提供了有科学的实验证据。这是我们实验室目前已经开发出来的功能，并在博士研究生“术中心肌细胞保护的数学模型研究”课题中取得了满意的结果。
3.5　蛋白质浓度测定
用紫外 - 可见分光光度计测定蛋白质浓度的历史已由来已久 , 但现代的分光光度计法测蛋白质浓度已经实现计算机程序化 , 能快速、方便进行样品的蛋白浓度检测。DU-730 分光光度计能用多种方法测定蛋白浓度 , 如 :Bradford 法、Lowry 法、紫外吸收法和目前国内外普遍采用的 BCA 法 , 可以根据自己的实验室条件和需要 , 选择分析模式。
3.6　核酸分析
DU-730 分光光度计除能测定多种生化物质含量，还能进行核酸的生物学分析。这里包括 :dsDNA、ssDNA 和 RNA 浓度测定，以及有关核酸的其他分析，如 : 核酸的纯度、延伸盒系数、融解温度 (Tm) 等，方便快速。

4　DU-730 分光光度计的使用与维护
4.1　正确使用分光光度计
DU-730 分光光度计操作简便。打开仪器电源开关，仪器应顺利通过自检，然后预热 10 分钟左右，可以进行测定。读数时应记录最先显示的数值，不要让样品连续光照时间太长 ( 动力学测定除外 )，特别是在紫外区域测定时更要快速，因为随着光的连续照射读数会下降，变得不稳定。而应用显色剂显色后会使读数稳定， 给测定带来方便，同时还会使物质中许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万，明显提高了检测灵敏度 [5]。
4.2　显示屏的维护
DU-730 分光光度计的显示屏比较特殊，它既是数据显示屏，又是仪器的操作键盘，即触摸屏。为为避免刮伤，操作时不能用手指、笔头等硬物触摸，要用软布，如棉签点触。显示屏被弄脏时，可用水浸湿的软布轻轻擦拭，不要用有机溶剂擦拭。
4.3　比色杯的使用和维护
比色杯是光线通过样品池的重要元件，特别是它投光的两面光学窗被污染或腐蚀，将直接影响测定结果。测定时，样品量一定要按不同规格的比色杯的要求加够规定的体积，如 : 用微量杯样品量时，样品量不能少于 50霯，用常量杯时样品量不能少于 2mL，这样才能读数准确，结果真实。每次测定结束时，应及时用蒸馏水清洗比色杯，至少三遍，倒置晾干后，放入干燥洁净的盒中保存，如玻璃平皿。因为如果忘记冲洗，残留的样品液蒸发后会沉淀于杯窗上，影响透光。最好测定结束后，将比色杯放在蒸馏水中浸泡，将里外都冲洗干净，千万不要放在去污剂中，那样，会腐蚀光学材料，最好用专门的清洗剂(Trick-klean)。清洗时应注意一定不要用刷子刷玻璃透光面。如果上述较温和的清洗剂 ( 水、中性去污剂 ) 还不能洗掉沉淀在玻璃上的污物，可自行配制以下一种清洗剂 [6]，非常好用 :乙醇 :3mol/L 盐酸溶液 = 1 ∶ 1( 体积比 )将脏的比色杯放入上述盐酸 - 乙醇溶液中浸泡，注意 : 仅浸泡 20 秒钟即可，立即用蒸馏水冲洗掉，倒置晾干。
在使用比色杯时应特别注意防止光学面的材料被污染和腐蚀。无论是测定样品还是清洁剂都避免使用强碱性、浓无机酸和挥发性溶剂，因为它们会形成一层薄膜，进而腐蚀比色杯的光学面，降低比色杯的透光性，引起光的散射。
4.4　定期检定
分光光度计属于实验室计量仪器的一种，按国家标准 [7] 必须定期检定，进行量值溯源。只有定期检定，才能确保仪器波长的精确度，从而才能保证测定的准确性，同时还能及时发现仪器存在的问题。